陆地棉基因GhMIPS1A的克隆及功能分析

徐婷婷, 张弛, 冯震, 刘其宝, 李黎贝, 俞啸天, 张雅楠, 喻树迅

PDF(29422 KB)
更多内容请点击
PDF(29422 KB)
棉花学报 ›› 2022, Vol. 34 ›› Issue (2) : 93-106. DOI: 10.11963/cs20210018
研究与进展

陆地棉基因GhMIPS1A的克隆及功能分析

作者信息 +

Cloning and functional analysis of GhMIPS1A gene in upland cotton (Gossypium hirsutum L.)

Author information +
History +

摘要

【目的】 对肌醇-1-磷酸合酶（myo-inositol-1-phosphate synthase,MIPS）基因GhMIPS1A进行功能分析,探究其在陆地棉纤维发育及抗逆过程中的作用。【方法】 通过系统发育分析、基因结构分析、保守基序分析、荧光定量分析、烟草瞬时转化、拟南芥过表达试验、病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术等对GhMIPS1A基因进行研究。【结果】 从陆地棉TM-1中克隆获得GhMIPS1A基因,通过生物信息学分析发现该基因编码蛋白中存在4个高度保守的序列,分别为GWGGNNG、LWTANTERY、NGSPQNTFVPGL和SYNHLGNNDG。亚细胞定位结果显示,GhMIPS1A蛋白位于细胞膜。在拟南芥中过表达GhMIPS1A基因可促使拟南芥根长显著增加,肌醇含量提高1倍以上。空间表达模式分析表明,GhMIPS1A基因在根、茎、叶、纤维中优势表达,且在高衣分品种新陆早18号中的表达量显著高于其在低衣分品种德字棉531中的表达量;表达模式分析表明,GhMIPS1A基因在纤维发育早期阶段表达量较高。利用VIGS技术沉默TM-1的GhMIPS1A基因,3个株系的棉纤维密度显著降低,衣分分别降低4.48、4.93、3.95百分点,肌醇含量分别降低31.83%、32.90%、29.46%。在干旱处理或盐处理下,GhMIPS1A基因的表达量均表现出先升高后降低的趋势。【结论】 GhMIPS1A在棉纤维发育中发挥积极作用,并且能够响应干旱胁迫和盐胁迫,可以为培育优质高产、耐盐耐旱的棉花新品种提供基因资源和遗传基础。

Abstract

[Objective] The purpose of this study is to analyze the function of myo-inositol-1-phosphate synthase gene GhMIPS1A in fiber development and stress resistance of upland cotton (Gossypium hirsutum L.). [Method] Phylogenetic analysis, gene structure analysis, conserved motif analysis, quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), tobacco transient transformation over-expression in Arabidopsis, and virus-induced gene silencing (VIGS) were performed to study the functions of GhMIPS1A. [Result] GhMIPS1A gene was cloned from upland cotton TM-1. Bioinformatics analysis showed that there were four highly conserved motifs, which were GWGGNNG, LWTANTERY, NGSPQNTFVPGL, and SYNHLGNNDG. GhMIPS1A was localized to the cell membrane. Overexpression of GhMIPS1A gene in Arabidopsis thaliana resulted in elongation of root, and a more than 1-fold increase of inositol content. The temporospatial expression pattern analysis showed that GhMIPS1A gene was highly expressed in root, stem, leaf, and fiber, and the expression level in Xinluzao 18 with high lint percentage was significantly higher than that of in Delfos 531 with low lint percentage. And GhMIPS1A gene had a high expression level at the initial stage of fiber development. Compared with the wild type, the cotton fiber density of three GhMIPS1A-silenced lines significantly decreased, and the lint percentage decreased by 4.48, 4.93, and 3.95 percentage points, and the inositol content decreased by 31.83%, 32.90%, and 29.46%, respectively. Under drought treatment or salt treatment, the expression level of GhMIPS1A gene increased first and then decreased. [Conclusion] GhMIPS1A gene plays an positive role in cotton fiber development and can respond to drought stress and salt stress, which can provide genetic resources and genetic basis for the breeding of new cotton varieties with high yield, fine fiber, and salt and drought tolerance.

关键词

陆地棉 / GhMIPS1A / 基因功能 / 纤维发育 / 抗逆性 / 耐盐性 / 耐旱性

Keywords

upland cotton / GhMIPS1A / gene function / fiber development / stress tolerance / salt tolerance / drought tolerance

引用本文

EndNote

Ris (Procite)

Bibtex

导出引用
徐婷婷 , 张弛 , 冯震 , 刘其宝 , 李黎贝 , 俞啸天 , 张雅楠 , 喻树迅. 陆地棉基因GhMIPS1A的克隆及功能分析[J]. 棉花学报, 2022, 34(2): 93-106. https://doi.org/10.11963/cs20210018
Xu Tingting , Zhang Chi , Feng Zhen , Liu Qibao , Li Libei , Yu Xiaotian , Zhang Yanan , Yu Shuxun. Cloning and functional analysis of GhMIPS1A gene in upland cotton (Gossypium hirsutum L.)[J]. Cotton Science, 2022, 34(2): 93-106. https://doi.org/10.11963/cs20210018
肌醇（myo-inositol）,又称环己六醇,分子式是C6H12O6,结构类似于葡萄糖。大量研究表明,肌醇是植物生长发育所必需的[1],可以作为重要的前体和原料,广泛参与植物细胞壁和细胞膜的生物合成、生长发育、细胞膜信号转导、逆境调节等多种生命活动 [2⇓-4]。肌醇的合成主要分为3个步骤：首先D-葡萄糖在己糖激酶的作用下磷酸化生成D-葡萄糖-6-磷酸,然后D-葡萄糖-6-磷酸在肌醇-1-磷酸合酶（myo-inositol-1-phosphate synthase, MIPS）[5]的作用下环化生成肌醇-1-磷酸,最后肌醇-1-磷酸在肌醇单磷酸酶的作用下脱磷酸化生成游离的肌醇,其中MIPS是限速酶,在维持肌醇稳态中起关键作用[6]。研究表明,MIPS不仅可以作为限速酶参与肌醇的合成,还可以作为转录调控因子参与植物的生长发育[7]。
MIPS广泛存在于原核生物和真核生物中,目前已经在高等植物、动物、真菌、细菌等多种生物中被分离并检测出活性[8]。已有多项研究表明MIPS在植物的耐盐性、耐旱性、生长发育中发挥重要作用[9-10]。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中已鉴定出3个MIPS基因,分别为AtMIPS1、AtMIPS2、AtMIPS3[11]。其中,AtMIPS1在种子发育中起关键作用,缺失AtMIPS1会导致抗坏血酸（ascorbic acid, AsA）和磷脂酰肌醇含量减少,从而导致子叶出现病斑、叶片卷曲、植株矮化[12]。通过RNA干扰技术（RNA interference, RNAi）抑制马铃薯（Solanum tuberosum）中MIPS基因的表达,会导致叶片形态变化和块茎产量降低[13]。利用RNAi降低苹果（Malus pumila）中MdMIPS基因的表达,导致肌醇含量降低,进而导致细胞程序性死亡,叶和根坏死,最终造成植株死亡,表明MIPS在苹果中发挥重要的生理作用[14]。从1种盐生稻（Porteresia coarctata）中分离出MIPS耐盐基因PINO1,将该基因转入烟草（Nicotiana tabacum）植株后检测肌醇含量,发现转基因烟草在高盐环境中能够积累更多的肌醇,表明PINO1基因在植物的抗逆中起着关键作用[15]。转PdMIPS山新杨（Populus davidiana）比野生型山新杨具有更好的盐胁迫耐受性,说明PdMIPS基因参与植物抗逆胁迫过程[16]。在玉米中克隆获得2个ZmMIPS基因,发现这2个MIPS基因都能响应盐、干旱等多种非生物胁迫[17]。
棉花（Gossypium spp.）是世界上重要的经济作物之一[18],其中陆地棉（G. hirsutum）因产量高、纤维较长、品质较好是重要的栽培种[19]。目前,高产仍然是棉花育种的主要目标[20]。棉纤维是由胚珠外突起的表皮细胞分化发育而来的,纤维突起的密度和衣分呈显著正相关。大量研究表明,棉花产量与衣分有着十分密切的关系[21]。GhMIPS1D基因在陆地棉纤维细胞起始期和伸长期早期高水平表达,且可以有效地弥补拟南芥mips1突变体的生长发育缺陷[22]。近年来,土壤盐渍化和干旱等非生物胁迫因素同样严重制约着棉花产量的提高[23]。因此,利用各种分子育种手段挖掘潜在的有价值的基因并进行功能分析,从而提高棉花在逆境中的生存能力和产量显得尤为重要[24-25]。研究表明,肌醇的氧化产物D-葡萄糖醛酸（D-glucuronic acid, GlcA）可用于细胞壁果胶类非纤维素化合物和抗坏血酸的合成。果胶前体、抗坏血酸以及由抗坏血酸过氧化物酶催化的代谢产物在棉纤维伸长发育中起关键作用[26]。
宿俊吉[27]利用简化测序的关联分析结合连锁分析定位到与陆地棉衣分相关的候选基因GhMIPS1A（Gh_A02G1268）,属于MIPS基因家族成员,比对后发现该基因与拟南芥调节胚胎、种子发育的基因AtMIPS2（AT2G22240）同源。目前对于MIPS参与棉纤维发育过程的调控机制研究较少。因此,本研究从陆地棉标准系材料TM-1中克隆得到GhMIPS1A基因,通过生物信息学分析、亚细胞定位、拟南芥过表达试验、病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技术和逆境胁迫响应分析,对该基因的功能进行初步研究,为培育抗逆高产的棉花新品种提供优质的基因资源。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

将陆地棉材料TM-1、新陆早18号、德字棉531种植于浙江农林大学平山温室试验基地。选取新陆早18号和德字棉531的根、茎、叶、萼片、花瓣、雄蕊,以及开花前3 d（-3 days post anthesis, -3 DPA）、开花当天、开花后3 d和5 d的胚珠（5 DPA及之前纤维与胚珠无法准确区分）,开花后10 d、15 d和20 d的胚珠和纤维用于实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）分析,每个样品取3个生物学重复。
使用本生烟（N. benthamiana）进行瞬时转化,材料种植于浙江农林大学人工气候室,温室的培养条件为：温度22 ℃,光照16 h/黑暗8 h,相对湿度75%。
使用拟南芥哥伦比亚型（Col-0）进行遗传转化,材料种植于浙江农林大学人工气候室,培养条件为：温度25 ℃,光照16 h/黑暗8 h,相对湿度50%。

1.2 载体和试剂

所用的载体pBI121、pCAMBIA3301、pCLCrVA、pCLCrVB保存于本课题组。大肠杆菌DH5α感受态、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株GV3101、LBA4404感受态购于上海唯地生物公司。限制性内切酶购于NEB公司。DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。多糖多酚植物的RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司。GXL DNA Polymerase高保真酶、反转录试剂盒、荧光试剂TB Green○R Premix Ex Taq TMⅡ（Tli RnaseH Plus）购于宝日医生物技术（北京）有限公司。乙酰丁香酮、2-吗啉乙磺酸、1/2 MS固体培养基购于源叶生物。肌醇提取试剂盒、D-葡萄糖提取试剂盒购于北京智微科技有限公司。引物合成和测序由杭州有康生物有限公司完成。本研究所用引物序列见表1。
表1 本研究中使用的引物

Table 1 Primers used in this study

引物名称Primer name 引物序列Primer sequence 用途Purpose
GhMIPS1A-F TGGGGCAAAAGAGAAATAA 基因克隆
GhMIPS1A-R AAGGGAAAATGGTCCTAAAG Gene cloning
GhMIPS1A-XbaI-F CTCTAGATGGGGCAAAAGAGAAATAA 构建表达载体
GhMIPS1A-SacI-R CGAGCTCAAGGGAAAATGGTCCTAAAG Construction of expression vector
GhMIPS1A-qF GCAAAAGCAACTGAGACCCTAC 检测GhMIPS1A的表达
GhMIPS1A-qR ACCTCTCAGTGTTTGCAGTCC qRT-PCR of GhMIPS1A
GhHistone3-F TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA 检测GhHistone3的表达
GhHistone3-R GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC qRT-PCR of GhHistone 3
VIGS-F GGACTAGTGCAAAAGCAACTGAGACCCTAC VIGS载体构建
VIGS-R TTGGCGCGCCACCTCTCAGTGTTTGCAGTCC Construction of VIGS vector
pCAMBIA3301-GFP-F CGAGCTCGTGGGGCAAAAGAGAAATAA 亚细胞定位
pCAMBIA3301-GFP-R GGACTAGTCTTGTATTCCAAAATCATGTTGTT Subcellular localization
注：下划线示酶切位点。
Note: The underline represents the restriction sites of restriction endonucleases.

1.3 棉花DNA、RNA的提取与基因表达分析

棉花DNA的提取参考说明书。参考多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书,提取1.1中各材料的RNA。使用反转录试剂盒进行反转录,合成第一条链互补DNA（complementary DNA, cDNA）。将得到的cDNA加水稀释50倍后作为qRT-PCR模板。反应体系参考试剂盒说明书,使用Stepone Plus Real-time PCR System仪器检测分析,每个材料进行3次技术重复。以GhHistone 3为棉花的内参基因,以AtUBQ5为拟南芥的内参基因。

1.4 陆地棉GhMIPS1A基因的克隆及生物信息学分析

从CottonFGD网站（http://cottonfgd.org/）获得Gohir.A02G132300基因的全长序列,该基因位于A02染色体上,根据Ma等[22]的命名规则,将其命名为GhMIPS1A。从陆地棉TM-1中克隆GhMIPS1A基因,通过双酶切构建过表达载体PBI121-GhMIPS1A。通过热激法转化农杆菌GV3101。通过CottonFGD网站获得陆地棉、雷蒙德氏棉（G. raimondii）、亚洲棉（G. arboreum）和海岛棉（G. barbadense）中MIPS蛋白序列。通过NCBI在线网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）查找获得榴莲（Durio zibethinus）、可可（Theobroma cacao）、大豆（Glycine max）、拟南芥、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）6个物种的MIPS蛋白序列。使用ClustalX（http://www.clustal.org/）进行氨基酸序列比对,利用MEGA 7.0软件（http://www.mega-software.net/）采用邻接法构建系统进化树,自展值设为1 000,其余参数设置为默认值。使用DNAMAN软件对GhMIPS1A氨基酸序列进行保守性分析。使用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）进行外显子-内含子结构分析。

1.5 亚细胞定位分析

采用冻融法,将构建的35S∷GhMIPS1A-GFP融合表达载体、35S∷GFP空载体转化农杆菌菌株GV3101。利用烟草瞬时转化进行亚细胞定位,选取生长4周左右的烟草的第三或第四片平滑且完整的叶片进行注射。注射后避光培养24 h,恢复光照继续培养48 h,然后在蔡司LSM510激光共聚焦显微镜下进行观察并拍照。

1.6 病毒诱导的基因沉默试验及拟南芥转化

参考Gu等[28]的具体试验步骤构建VIGS载体并进行棉花侵染。VIGS所用载体系统为：pCLCrVA（空载体）、pCLCrVB（辅助载体）、pCLCrVA-PDS（阳性对照）。以TM-1叶片cDNA为模板进行基因片段的克隆,构建pCLCrVA-GhMIPS1A载体并转化农杆菌LBA4404。阳性菌液可添加终浓度为20%（体积分数）甘油,长期保存于-80 ℃冰箱。将TM-1种子播种于育苗盘,放于长日照条件（16 h光照/8 h黑暗）下的光照培养箱培养,待生长至子叶完全展平后使用注射法侵染棉花幼苗子叶,以pCLCrVA-PDS作为阳性对照,侵染后的棉花幼苗在黑暗中放置24 h后,重新放置于培养箱（25 ℃,16 h光照/8 h黑暗）培养,后续持续观察表型。
采用花序侵染法,将构建好的GhMIPS1A过表达载体转化拟南芥,使用含有卡那霉素的1/2 MS固体培养基筛选转基因株系,对筛选的阳性植株移栽并进行检测。至T3进行阳性鉴定、表型观察、肌醇含量测定。

1.7 代谢物肌醇和D-葡萄糖含量的测定

待测样品制备方法：精确称取并记录植物样品组织质量,加入适量蒸馏水,使用研磨机粉碎制成匀浆,将匀浆完全转移至干净的100 mL容量瓶中备用,按照肌醇提取试剂盒说明书测定肌醇含量和D-葡萄糖含量。

1.8 干旱、盐胁迫处理及脯氨酸、丙二醛含量的测定

将TM-1棉花种子播种于育苗盘,放于长日照条件（16 h光照/8 h黑暗）下的光照培养箱培养生长,待棉花生长至幼苗4叶期,选取展平的真叶在水中培养1 d后,将离体叶片分别转移至含有200 mmol·L-1 NaCl及20%（质量分数）聚乙二醇6000（PEG 6000）溶液中进行胁迫处理,以水处理的叶片作为对照[29-30]。分别在处理0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h后进行取样,样品立即用蒸馏水洗净后擦干水分,用剪刀去掉叶脉,剩余部分剪成0.5 cm×0.5 cm小块,在液氮中速冻后,于-80 ℃冰箱储存或直接用于RNA提取、生理指标的测定。以上样品均取3个生物学重复。脯氨酸（proline, Pro）含量测定方法为酸性茚三酮法[31],丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量测定方法为硫代巴比妥酸法[32]。

2 结果与分析

2.1 MIPS基因家族成员鉴定及保守序列分析

MIPS基因家族是一个非常小的家族,在大多数植物中通常包含1~2个成员。但是在陆地棉和海岛棉中分别发现4个MIPS基因。为研究MIPS基因家族在植物中的进化特征,将陆地棉、海岛棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉、榴莲、可可、大豆、拟南芥、玉米、水稻10个物种中的29个MIPS蛋白序列进行系统进化分析,结果显示单子叶植物的MIPS蛋白聚在一起,双子叶植物的MIPS蛋白聚在一起（图1）。将GhMIPS1A和其他6个物种的MIPS蛋白进行多序列比对发现,MIPS蛋白在植物中的保守性很高,氨基酸序列相似性高达93%,并且存在4段高度保守的序列（图2）：GWGGNNG、LWTANTERY、NGSPQNTFVPGL、SYNHLGNNDG,推测这4个保守基序对于MIPS发挥功能至关重要。
图1 10种植物的29个MIPS同源蛋白序列的进化分析

Fig. 1 Phylogenetic analysis of 29 MIPS proteins of ten species

Full size|PPT slide

图2 7个代表性植物MIPS蛋白的多重序列比对
方框标识4个保守序列。

Fig. 2 Multiple sequence alignment of MIPS proteins in seven representative plants

The four boxes show conserved sequences.

Full size|PPT slide

2.2 MIPS基因的结构分析

为了进一步研究MIPS基因家族成员的进化关系,对4个陆地棉MIPS基因序列和其他9个植物25个MIPS基因进行外显子-内含子结构分析。在绝大多数高等植物中,MIPS基因都有10个外显子,说明MIPS基因在进化过程中高度保守。然而拟南芥中AtMIPS1 和AtMIPS12基因分别含有9个和7个外显子,这表明拟南芥在进化过程中可能经历了特殊的进化事件（图3）。
图3 10种代表性植物MIPS基因的外显子-内含子结构

Fig. 3 Exon-intron structure of MIPS genes in ten species

Full size|PPT slide

2.3 GhMIPS1A的时空表达模式分析

为了探究GhMIPS1A的组织表达特性和空间表达特性,分别使用高衣分材料新陆早18号和低衣分材料德字棉531进行基因表达分析,结果显示：GhMIPS1A在0 DPA、3 DPA、5 DPA的胚珠中较高水平表达（图4A）,在根、茎、叶、纤维中表达量较高（图4B）,而且GhMIPS1A基因在高衣分材料新陆早18号上述器官中的表达量均高于其在低衣分材料德字棉531中的表达量（图4）。由此推测,该基因在陆地棉纤维发育早期发挥重要作用,可能影响陆地棉的产量。
图4 GhMIPS1A的时空表达分析
A：GhMIPS1A在不同时期的纤维和胚珠中的相对表达量;B：GhMIPS1A基因在不同器官中的相对表达量。**: 两个材料间GhMIPS1A表达量差异显著（P<0.01）。

Fig. 4 Temporal and spatial expression patterns of GhMIPS1A

A: Relative expression of GhMIPS1A in fiber and ovule at different stages; B: Relative expression level of GhMIPS1A in different organs. ** means significant difference of GhMIPS1A expression between Xinluzao 18 and Delfos 531 at the 0.01 probability level.

Full size|PPT slide

2.4 GhMIPS1A的亚细胞定位

亚细胞定位试验观察发现,GhMIPS1A-GFP融合蛋白的绿色荧光仅分布于细胞膜（图5A~C）,而对照的荧光分布于整个细胞中（图5D~F）。
图5 GhMIPS1A蛋白的亚细胞定位

Fig. 5 Subcellular localization of GhMIPS1A protein

Full size|PPT slide

2.5 病毒诱导的GhMIPS1A基因沉默

转化pCLCrVA-PDS的阳性对照植株整株叶片出现不同程度的白化现象,表明该沉默系统成功且有效。转化空载体的对照植株及GhMIPS1A沉默植株在表型上并没有明显差异（图6A）。qRT-PCR结果表明,在GhMIPS1A沉默株系VL1、VL2、VL3中,GhMIPS1A的表达量不同程度地降低,说明该基因被成功沉默（图6B）。测定代谢物肌醇和D-葡萄糖的含量（图6C）发现,随着GhMIPS1A基因的沉默,肌醇含量也随之显著降低,3个沉默株系的肌醇含量分别降低31.83%、32.90%、29.46%,但葡萄糖含量无显著变化。测定成熟棉铃衣分发现,与空载体对照植株相比,GhMIPS1A沉默植株的纤维密度降低（图6D）,3个GhMIPS1A沉默株系VL1、VL2、VL3的衣分分别降低4.48、4.93、3.95百分点（图6E）。
图6 GhMIPS1A沉默植株的表型
A：GhMIPS1A沉默植株的表型;B：GhMIPS1A沉默植株中GhMIPS1A的表达量;C：GhMIPS1A沉默植株中肌醇和D-葡萄糖含量检测;D：GhMIPS1A沉默植株的纤维密度;E：GhMIPS1A沉默植株的衣分统计。不同小写字母表示差异达到显著水平。pCLCrVA-PDS和pCLCrVA分别是阳性对照和阴性对照,VL1~VL3是3个GhMIPS1A沉默植株。

Fig. 6 Phenotypes of GhMIPS1A-silenced plants

A: Phenotype of GhMIPS1A-silenced plant; B: Detection of GhMIPS1A expression in GhMIPS1A-silenced plants; C: Determination of inositol and D-glucose content in GhMIPS1A-silenced plants; D: Fiber density of GhMIPS1A-silenced plants; E: Lint percentage statistics of GhMIPS1A-silenced plants. Different lowercase letters indicate the significant difference at the 0.05 probability level. pCLCrVA-PDS: positive control; pCLCrVA: negative control; VL1, VL2, VL3: three GhMIPS1A-silenced plants.

Full size|PPT slide

2.6 GhMIPS1A在拟南芥中的功能研究

为了探究GhMIPS1A基因在植物生长发育过程中所发挥的功能,构建过表达载体转化拟南芥,得到3个过表达株系,分别为L1、L2、L3（图7A~B）。将T3种子播种于1/2 MS固体培养基上垂直培养1周,观察测定拟南芥根长,结果发现转基因拟南芥的根长显著长于野生型（图7A、7C）。同时测定肌醇含量和D-葡糖糖的含量发现,转基因拟南芥中肌醇含量比野生型拟南芥高1倍以上,但是D-葡萄糖含量无显著差异,其原因可能是D-葡萄糖的含量由多条不同的代谢途径共同决定（图7D）。
图7 GhMIPS1A基因在拟南芥中的功能研究
A：过表达GhMIPS1A基因拟南芥的根,标尺为1 cm;B：转基因拟南芥中GhMIPS1A的表达水平;C：转基因拟南芥不同株系的根长;D：转基因拟南芥中肌醇和D-葡萄糖含量。不同小写字母表示差异显著;WT：野生型,L1~L3：3个T3过表达GhMIPS1A基因拟南芥株系。

Fig. 7 Functional analysis of GhMIPS1A in A. thaliana

A: Root of GhMIPS1A transgenic A. thaliana, scale bar: 1 cm; B: Relative expression level of GhMIPS1A in different transgenic lines; C: Root length in transgenic lines; D: Determination of inositol and D-glucose contents in different transgenic lines. Different lowercase letters indicate the significant difference at the 0.05 probability level. WT: wild type, L1-L3: three T3 transgenic Arabidopsis lines.

Full size|PPT slide

2.7 干旱胁迫下和盐胁迫下GhMIPS1A的表达变化及相关代谢物含量的变化

为了分析GhMIPS1A在多种胁迫下的表达模式,本研究使用4叶期的陆地棉幼苗作为材料,分别进行干旱、高盐胁迫处理,检测处理后叶片脯氨酸和丙二醛含量。结果显示：随着干旱或盐胁迫处理时间的延长,脯氨酸的含量也随之增加（图8B）,同时丙二醛的含量整体呈现增加的趋势（图8A）,表明棉花叶片对胁迫做出了响应。qRT-PCR结果表明,无论是盐胁迫还是干旱胁迫,GhMIPS1A的表达量都呈现先增后减的趋势（图8C~D）,肌醇含量随着GhMIPS1A基因的表达呈现相同的变化趋势（图8E~F）,这些结果均表明GhMIPS1A基因积极响应盐胁迫和干旱胁迫,可能在抗逆胁迫过程中发挥重要作用。
图8 非生物胁迫下GhMIPS1A的表达模式及相关代谢物含量
A~B：20% PEG 6000和200 mmol·L-1 NaCl 处理下丙二醛含量（A）、脯氨酸含量（B）;C~F：20% PEG 6000或200 mmol·L-1 NaCl处理下GhMIPS1A的相对表达量（C~D）和肌醇含量（E~F）。

Fig. 8 Expression patterns of GhMIPS1A and relative metabolite contents under different abiotic stresses

A, B: MDA content and proline content in 20% PEG 6000 and 200 mmol·L-1 NaCl treatment; C-F: Relative expression level of GhMIPS1A (C, D) and inositol contents (E, F) in 20% PEG 6000 treatment or 200 mmol·L-1 NaCl treatment.

Full size|PPT slide

3 讨论

MIPS基因家族成员非常少,除了拟南芥有3个MIPS家族成员,陆地棉、海岛棉、大豆和玉米各有4个MIPS家族成员外,绝大多数植物中仅有1~2个成员[33]。所有高等植物MIPS基因大多编码约510个氨基酸,氨基酸序列相似性高达93%,且存在4个高度保守的基序,这与前人的研究结果[34-35]一致。而内含子-外显子结构分析显示拟南芥可能经历了复杂的进化事件。
MIPS是肌醇及其衍生物合成中的关键酶,在植物的生长发育、细胞壁和细胞膜的生成、信号转导、抗逆调节等过程中起关键调控作用。已有的研究表明,MIPS基因在陆地棉纤维发育的起始期和伸长期早期发挥重要的作用[22],棉花的产量通常由棉纤维起始期的突起细胞数目决定,分析高低衣分材料间基因表达量的差异,推测GhMIPS1A可能是控制陆地棉产量的正向调控因子。
在拟南芥中发现3个MIPS基因AtMIPS1、AtMIPS2、AtMIPS3。其中,AtMIPS1对于种子的发育至关重要,缺少AtMIPS1可使脱落酸和肌醇衍生物含量减少,从而产生叶片卷曲、植株矮小、子叶病变等异常表型。MIPS能够改变植物细胞壁和细胞膜的通透性,促进植物细胞对营养成分的吸收转运,在植物对逆境胁迫的耐受中起非常重要的作用。在拟南芥中过表达GhMIPS1A基因,转基因拟南芥的根长显著增加,肌醇含量也随着提高。亚细胞定位结果显示MIPS蛋白定位于细胞膜中,由此推测GhMIPS1A基因是参与细胞信号转导、影响植物生长的重要信号分子。
已有报道表明,果胶前体物质和抗坏血酸对于棉纤维的生长发育是必不可少的[36-37],MIPS影响果胶前体UDP-D-葡萄糖醛酸和抗坏血酸的合成[38]。UDP-D-葡萄糖醛酸、磷脂酰肌醇和磷脂酰肌醇激酶是重要的肌醇衍生物,已被证明是细胞壁、细胞膜的重要组成部分,参与棉花纤维的伸长生长[39]。为了进一步探究GhMIPS1A在陆地棉中发挥的作用,本研究通过VIGS试验沉默GhMIPS1A基因在棉花TM-1中的表达,导致肌醇含量降低,发现随着该基因表达量的降低,棉花的纤维密度和衣分均降低,初步表明GhMIPS1A基因对于陆地棉棉纤维的生长发育起正向调控的作用。若要进一步明确GhMIPS1A基因在纤维发育过程中所发挥的作用,则需要进行更深入的研究。如针对该基因构建CRISPR-Cas9载体,获得突变株系进一步探究其在陆地棉中的调控机制。
肌醇是植物的第二信使分子1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）的前体物质,IP3通过液泡膜和粗糙内质网上的钙离子通道结合,激活钙调蛋白,形成Ca2+/CaM复合物,并激活一系列下游蛋白,从而调控与抗逆胁迫相关的一系列级联反应[40]。肌醇的生物合成是不同生化途径高度调控的过程,因此GhMIPS1A基因是如何与其他相关酶基因相互协作参与肌醇代谢通路调控,以及如何和生长素、赤霉素等植物激素相互作用影响植物的生长发育需深入挖掘。
干旱、盐碱等非生物胁迫是限制植物生长发育和作物产量的主要因素,因此挖掘优异的耐盐耐旱基因资源具有重要的现实意义[41]。本研究利用200 mmol·L-1 NaCl和20% PEG 6000处理模拟盐胁迫和干旱胁迫环境,发现GhMIPS1A基因可以快速响应逆境胁迫,且肌醇含量在盐胁迫和干旱胁迫下显著增加。然而,该基因在逆境胁迫响应信号中的位置以及如何作用尚不清楚,需进行更深入的研究验证其耐盐、耐旱性。

4 结论

本研究从陆地棉TM-1中克隆出1个MIPS基因,将其命名为GhMIPS1A。通过氨基酸序列保守性分析、系统发育树分析、外显子-内含子结构分析表明MIPS在进化过程十分保守。亚细胞定位结果显示GhMIPS1A蛋白定位于细胞膜。GhMIPS1A基因在根、茎、叶、纤维组织中具有较高的表达量,在纤维发育的起始期和伸长期早期优势表达,且在高低衣分材料中的表达量有显著差异。过表达GhMIPS1A基因的拟南芥植株根长增加,肌醇含量随之增加。VIGS技术沉默GhMIPS1A基因后的棉花植株出现纤维密度降低的现象,且衣分也随之减少。GhMIPS1A基因在盐胁迫、干旱胁迫响应途径中具有积极作用。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序
[1]
Hallman M, Epstein B L. Role of myo-inositol in the synthesis of phosphatidylglycerol and phosphatidylinositol in the lung[J/OL]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1980, 92(4): 1151-1159[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/0006-291x(80)90407-6.
https://doi.org/10.1016/0006-291x(80)90407-6
本文引用 [1]
[2]
Toker A. The synthesis and cellular role of phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate[J/OL]. Current Opinion in Cell Biology, 1998, 10(2): 254-261[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/s0955-0674(98)80148-8.
https://doi.org/10.1016/s0955-0674(98)80148-8
本文引用 [1]
[3]
Otto J C, Kelly P, Chiou S T, et al. Alterations in an inositol phosphate code through synergistic activation of a G protein and inositol phosphate kinases[J/OL]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(40): 15653-15658[2021-03-01]. https://doi.org/10.1073/pnas.0705729104.
https://doi.org/10.1073/pnas.0705729104
本文引用 [1]
[4]
Raboy V. Myo-inositol-1, 2, 3, 4, 5, 6-hexakisphosphate[J/OL]. Phytochemistry, 2003, 64(6): 1033-1043[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/s0031-9422(03)00446-1.
https://doi.org/10.1016/s0031-9422(03)00446-1
本文引用 [1]
[5]
张梦, 谢益民, 杨海涛, 等. 肌醇在植物体内的代谢概述——肌醇作为细胞壁木聚糖和果胶前体物的代谢途径[J]. 林产化学与工业, 2013, 33(5): 106-114.
Zhang Meng, Xie Yimin, Yang Haitao, et al. Myo-inositol metamolism as the precursor of xylan and pectin in plant[J]. Chemistry and Industry of Forest Products, 2013, 33(5): 106-114.
本文引用 [1]
[6]
Majumder A L, Johnson M D, Henry S A. 1L-myo-inositol-1-phosphate synthase[J/OL]. Biochimica Biophysica Acta, 1997, 1348(1/2): 245-256[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(03)00974-8.
https://doi.org/10.1016/s0014-5793(03)00974-8
本文引用 [1]
[7]
Latrasse D, Jegu T, Meng P H, et al. Dual function of MIPS1 as a metabolic enzyme and transcriptional regulator[J/OL]. Nucleic Acids Research, 2013, 41(5): 2907-2917[2021-03-01]. https://doi.org/10.1093/nar/gks1458.
https://doi.org/10.1093/nar/gks1458
本文引用 [1]
[8]
Bachhawat N, Mande S C. Complex evolution of the inositol-1-phosphate synthase gene among archaea and eubacterial[J/OL]. Trends in Genetics, 2000, 16(3): 111-113[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/s0168-9525(99)01966-6.
https://doi.org/10.1016/s0168-9525(99)01966-6
本文引用 [1]
[9]
Zhai H, Wang F B, Si Z Z, et al. A myo-inositol-1-phosphate synthase gene, IbMIPS1, enhances salt and drought tolerances and stem nematode resistance in transgenic sweet potato[J/OL]. Plant Biotechnology Journal, 2016, 14(2): 592-602[2021-03-01]. https://doi.org/10.1111/pbi.12402.
https://doi.org/10.1111/pbi.12402
本文引用 [1]
[10]
Tan J L, Wang C Y, Xiang B, et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide mediated cold and dehydration-induced myo-inositol phosphate synthase that confers multiple resistances to abiotic stresses[J/OL]. Plant Cell & Environment, 2013, 36(2): 2907-2917[2021-03-01]. https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2012.02573.x.
https://doi.org/10.1111/j.1365-3040.2012.02573.x.
本文引用 [1]
[11]
Murphy A M, Otto B, Brearley C A, et al. A role for inositol hexakisphosphate in the maintenance of basal resistance to plant pathogens[J/OL]. The Plant Journal, 2008, 56(4): 638-652[2021-03-01]. https://doi.org10.1111/j.1365-313X.2008.03629.x.
https://doi.org10.1111/j.1365-313X.2008.03629.x.
本文引用 [1]
[12]
Donahue J L, Alford S R, Torabinejad J, et al. The Arabidopsis myo-inositol-1-phosphate synthase1 gene is required for myo-inositol synthesis and suppression of cell death[J/OL]. The Plant Cell, 2010, 22(3): 888-903[2021-03-01]. https://doi.org/10.1105/tpc.109.071779.
https://doi.org/10.1105/tpc.109.071779
本文引用 [1]
[13]
Keller R, Brearley C A, Rethewey R N, et al. Reduced inositol content and altered morphology in transgenic potato plants inhibited for 1-D-myo-inositol 3-phosphate synthase[J/OL]. The Plant Journal, 1998, 16(3): 403-410[2021-03-01]. https://doi.org/10.1034/j.1399-5618.2002.00108.x.
https://doi.org/10.1034/j.1399-5618.2002.00108.x.
本文引用 [1]
[14]
Hu L Y, Zhou J, Ren G J, et al. Myo-inositol mediates reactive oxygen species-induced programmed cell death via salicylic acid-dependent and ethylene-dependent pathways in apple[J/OL]. Horticulture Research, 2020, 7: 138-145[2021-03-01]. https://doi.org/10.1038/s41438-020-00357-2.
https://doi.org/10.1038/s41438-020-00357-2
本文引用 [1]
[15]
Majee M S, Maitra K G, Dastidar, et al. A novel salt-tolerant L-myo-inositol-1-phosphate synthase from Porteresia coarctata (Roxb.) tateoka, a halophytic wild rice: molecular cloning, bacterial overexpression, characterization, and functional introgression into tobacco-conferring salt tolerance phenotype[J/OL]. The Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(27): 28539-28552[2021-03-01]. https://doi.org/10.1074/jbc.M310138200.
https://doi.org/10.1074/jbc.M310138200
本文引用 [1]
[16]
杨楠. 杨树肌醇代谢关键酶基因的表达及功能研究[D]. 烟台: 鲁东大学, 2017.
Yang Nan. Expression and function of inositol metabolism key enzyme gene in poplar[D]. Yantai: Ludong University, 2017.
本文引用 [1]
[17]
郝广龙. 玉米肌醇-1-磷酸合成酶基因 ZmMIPS 的克隆及其抗旱功能鉴定[D]. 杨凌:西北农林科技大学, 2019.
Hao Guanglong.. Cloning of maize myo-inositol-1-phosphate synthase gene (ZmMIPS) and functional characterization of its drought tolerance[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2019.
本文引用 [1]
[18]
Qin Y M, Zhu Y X. How cotton fibers elongate: a tale of linear cell-growth mode[J/OL]. Current Opinion in Plant Biology, 2011, 14(1): 106-111[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2010.09.010.
https://doi.org/10.1016/j.pbi.2010.09.010
本文引用 [1]
[19]
Wendel J F, Flagel L E, Adams K L. Jeans, genes, and genomes: cotton as a model for studying polyploidy[M/OL]. SoltisP S, SoltisD. Polyploidy and genome evolution. Berlin: Springer, 2012, 181-207[2021-03-01]. https://doi.org/10.1007/978-3-642-31442-1.
https://doi.org/10.1007/978-3-642-31442-1
本文引用 [1]
[20]
喻树迅, 范术丽, 王寒涛, 等. 中国棉花高产育种研究进展[J/OL]. 中国农业科学, 2016, 49(18): 3465-3476[2021-03-01]. https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.18.001.
https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.18.001
Yu Shuxun, Fan Shuli, Wang Hantao, et al. Progresses in research on cotton high yield breeding in China[J/OL]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(18): 3465-3476[2021-03-01]. https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.18.001.
https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2016.18.001
本文引用 [1]
[21]
Shen X L, Guo W Z, Lu Q X, et al. Genetic mapping of quantitative trait loci for fiber quality and yield trait by RIL approach in upland cotton[J/OL]. Euphytica, 2007, 155(3): 371-380 [2021-03-01]https://doi.org/10.1007/s10681-006-9338-6.
https://doi.org/10.1007/s10681-006-9338-6
本文引用 [1]
[22]
Ma Rendi, Wang Yangsong, Wang Fei, et al. A cotton (Gossy-pium hirsutum) myo-inositol-1-phosphate synthase (GhMIPS1D) gene promotes root cell elongation in Arabidopsis[J/OL]. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(5): 1224[2021-03-01]. https://doi.org/10.3390/ijms20051224.
https://doi.org/10.3390/ijms20051224
本文引用 [3]
[23]
黄毅, 张玉龙. 保护地生产条件下的土壤退化问题及其防治对策[J/OL]. 土壤通报, 2004, 35(2): 212-216[2021-03-01]. https://doi.org/10.19336/j.cnki.trtb.2004.02.027.
https://doi.org/10.19336/j.cnki.trtb.2004.02.027
Huang Yi, Zhang Yulong. The soil degradation problem in green-house and control counter-measures[J/OL]. Chinese Journal of Soil Science, 2004, 35(2): 212-216[2021-03-01]. https://doi.org/10.19336/j.cnki.trtb.2004.02.027.
https://doi.org/10.19336/j.cnki.trtb.2004.02.027
本文引用 [1]
[24]
Ullah A, Nisar M, Ali H, et al. Drought tolerance improvement in plants: an endophytic bacterial approach[J/OL]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103(18): 7385-7397[2021-03-01]. https://doi.org/10.1007/s00253-019-10045-4.
https://doi.org/10.1007/s00253-019-10045-4
本文引用 [1]
[25]
Zhang H, Li Y Y, Zhu J K. Developing naturally stress-resistant crops for a sustainable agriculture[J/OL]. Nature Plants, 2018, 4(12): 989-996[2021-03-01]. https://doi.org/10.1038/s41477-018-0309-4.
https://doi.org/10.1038/s41477-018-0309-4
本文引用 [1]
[26]
Loewus F A. Inositol and plant cell wall polysaccharide bioge-nesis[J/OL]. Cell Biochemistry and Function, 2006, 39: 21-45[2021-03-01]. https://doi.org/10.1007/0-387-27600-9_2.
https://doi.org/10.1007/0-387-27600-9_2
本文引用 [1]
[27]
宿俊吉. 陆地棉早熟与产量纤维品质性状的全基因组关联分析及候选基因筛选[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2017.
Su Junji. identification of candidate genes and genome-wide association studies of traits related to early maturity, yield and fiber quality in upland cotton (Gossypium hirsutum L.)[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2017.
本文引用 [1]
[28]
Gu Z H, Huang C J, Li F F, et al. A versatile system for functional analysis of genes and microRNAs in cotton[J/OL]. Plant Biotechnology Journal, 2014, 12(5): 638-649[2021-03-01]. https://doi.org/10.1111/pbi.12169.
https://doi.org/10.1111/pbi.12169
本文引用 [1]
[29]
郭亚宁. NAC转录因子在陆地棉叶片衰老中的作用[D]. 杨凌: 西北农林科技大学, 2017.
Guo Yaning. The function of NAC transcription factors in leaf senescence of upland cotton[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2017.
本文引用 [1]
[30]
赵凤利. 棉花叶片衰老相关基因GhNAC12的功能分析[D]. 北京: 中国农业科学院, 2014.
Zhao Fengli. Functional analysis of GhNAC12, a leaf sene-scence-related gene in cotton (Gossypium hirsutum L.)[D]. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2014.
本文引用 [1]
[31]
吕淑霞. 基础生物化学实验指导[M]. 北京: 中国农业出版社, 2003.
Lü Shuxia. Basic biological chemistry experiment guidance[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2003.
本文引用 [1]
[32]
李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京: 高等教育出版社, 2000: 164-260.
Li Hesheng. Principles and techniques of plant physiology and biochemistry experiments[M]. Beijing: Higher Education Press, 2000: 164-260.
本文引用 [1]
[33]
Abid G, Silue S, Muhovski Y, et al. Role of myo-inositol phosphate synthase and sucrose synthase genes in plant seed development[J/OL]. Gene, 2009, 439(1/2): 1-10[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/j.gene.2009.03.007.
https://doi.org/10.1016/j.gene.2009.03.007
本文引用 [1]
[34]
Cui M, Liang D, Wu S, et al. Isolation and developmental expression analysis of L-myo-inositol-1-phosphate synthase in four Actinidia species[J/OL]. Plant Physiology and Biochemistry, 2013, 73: 351-358[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2013.10.015.
https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2013.10.015
本文引用 [1]
[35]
Basak P, Maitra-Majee S, Das J K, et al. An evolutionary analysis identifies a conserved pentapeptide stretch containing the two essential lysine residues for rice L-myo-inositol 1-phosphate synthase catalytic activity[J/OL]. PLoS One, 2017, 12(9): 73-78[2021-03-01]. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185351.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0185351
本文引用 [1]
[36]
Pang C Y, Wang H, Pang Y, et al. Comparative proteomics indicates that biosynthesis of pectic precursors is important for cotton fiber and Arabidopsis root hair elongation[J/OL]. Molecu-lar & Cellular Protemomics, 2010, 9(9): 2019-2033[2021-03-01]. https://doi.org/10.1074/mcp.M110.000349.
https://doi.org/10.1074/mcp.M110.000349
本文引用 [1]
[37]
Li H B, Qin Y M, Pang Y, et al. A cotton ascorbate peroxidase is involved in hydrogen peroxide homeostasis during fiber cell development[J/OL]. New Phytologist, 2007, 175(3): 462-471[2021-03-01]. https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2007.02120.x.
https://doi.org/10.1111/j.1469-8137.2007.02120.x.
本文引用 [1]
[38]
Kusuda H, Koga W, Kusano M, et al. Ectopic expression of myo-inositol 3-phosphate synthase induces a wide range of metabolic changes and confers salt tolerance in rice[J/OL]. Plant Science, 2015, 232: 49-56[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2014.12.009.
https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2014.12.009
本文引用 [1]
[39]
Liu G J, Xiao G H, Liu N J, et al. Targeted lipidomics studies reveal that linolenic acid promotes cotton fiber elongation by activating phosphatidylinositol and phosphatidylinositol monophosphate biosynthesis[J/OL]. Molecular Plant, 2015, 8(6): 911-921[2021-03-01]. https://doi.org/10.1016/j.molp.2015.02.010.
https://doi.org/10.1016/j.molp.2015.02.010
本文引用 [1]
[40]
Han S J, Yu B J, Wang Y, et al. Role of plant autophagy in stress response[J/OL]. Protein & Cell, 2011, 2(10): 784-791[2021-03-01]. https://doi.org/10.1007/s13238-011-1104-4.
https://doi.org/10.1007/s13238-011-1104-4
本文引用 [1]
[41]
刘楚楚, 吴玉香. 棉花RCI2基因家族的鉴定及表达分析[J]. 山西农业大学学报 (自然科学版), 2021, 41(4): 41-49.
Liu Chuchu, Wu Yuxiang. Identification and expression analysis of RCI2 gene family in cotton[J]. Journal of Shanxi Agricultural University (Natural Science Edition), 2021, 41(4): 41-49.
本文引用 [1]

基金

棉花生物学国家重点实验室自主课题(CB2021C15)
PDF(29422 KB)

421

Accesses

0

Citation

Detail
段落导航
相关文章
ISSN 1002-7807　CN 41-1163/S
主管：中国科学技术协会
主办：中国农学会
主编：李付广
版权所有 © 《棉花学报》编辑部
地址：河南省安阳市开发区黄河大道38号　中国农业科学院棉花研究所
邮政编码：455000　电话： (0372)2525361/362/369
E-mail: journal@caas.cn
访问统计
总访问量
今日访问
在线人数
技术支持：北京玛格泰克科技发展有限公司

/

〈 〉